生殖器疱疹应该如何进行诊断

　　患者信息：

　　姓名：李先生

　　性别：男

　　年龄：28

　　患病信息：怀疑是患了生殖器疱疹但不知道是不是，请问患了此病应该如何诊断?

　　针对以上描述，专家为您解答如下：

　　一、细胞学方法

　　对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou染色，可检出HSV感染特征的巨细胞包函体，但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。

　　二、培养法

　　从水疱底部取材做组织培养分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。

　　三、抗体检测

　　目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。

　　四、基因诊断

　　(一)用PCR分型检测单纯疱疹病毒

　　PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fg HSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。

　　1、标本采集和处理

　　(1)标本采集

　　①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色，应离心取上清。

　　②羊水及婴儿血清: 同上，应避免溶血.

　　③脑组织: 脑组织尸检、活检标本， 加1ml PBS标本缓冲液研磨后，待检。

　　④眼及皮肤病灶分泌物：用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物， 置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　⑤生殖器(宫颈、阴道、外阴、阴茎)标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1ml PBS标本缓冲液中送检。

　　(2)标本处理

　　①预处理：所有液体标本均可直接进行模板制备;可以取100μl标本液，离心5000 r/ minX5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。

　　②模板制备：

　　a: 蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h后，煮沸10 min，离心5000 r/ minX5min，收集上清。

　　b: 水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20 min，离心5000 r/ minX5min收集上清。

　　c: 1%Triton X-100裂解法:取采集的标本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ minX5min，收集上清。

　　d: 5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ minX5min收集上清。e: 如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μl DW溶解待检。

　　2、PCR扩增

　　(1)引物设计。以HSV DNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共彩虹引物，DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：

　　二个下游特异性引物，DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　)和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)，可以分别扩增出HSV-1 469bp DNA片段(1981～2359)、HSV-2 391bp片段(1561～1953)：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。

　　(2)PCR实验体系。取模板10μl： DNAP5 0.5(0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4XdNTP 8μl(4X200μmol/L)：10XdNTP 8μl(4X200μmol/L);10X缓冲液10μl：DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蜡油 30μl.。

　　水煮(96℃～100℃)7min

　　加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U)

　　72℃4 min 　　↓

　　95℃40s 　　↓,

　　65℃60s → 72℃70s 　　↓

　　33个循环

　　70℃4 min

　　3.扩增产物的检测和分析

　　(1)琼脂糖凝胶电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭(EB)染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。

　　(2)XhoI酶谱法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。

　　(3)Southern印迹法：PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90 min，转移至硝酸纤维素膜上：80℃烤膜2 h，42℃预杂交(杂交液中)30 min， 加入32p标记HSVP3探针后，42℃杂交过夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min; 膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h， 显影为阳性， 不显影为阴性。 

2012-11-13 16:28:34